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AAV-SP-C-iCre
1. SP-C 启动子介绍
肺脏是一个由超过40种不同类型的细胞构成器官，其中肺泡上皮细胞又主要分为I型（Type I Alveolar Epithelial Cells ，ATI）和（Type II Alveolar Epithelial Cells II，ATII）细胞，ATII细胞尽管仅占肺泡表面积的约5%，却承担着不可替代的角色。II型（ATII）细胞是肺泡表面活性剂的唯一合成和分泌来源，同时也是肺泡上皮再生的前体细胞，在肺损伤后分化为ATI细胞以修复受损的气血屏障。因此，ATII细胞成为了众多肺部疾病基因治疗的关键靶点。
肺表面活性蛋白（Surfactant Protein，SP）主要包括SP-A、SP-B、SP-C和SP-D四种，它们在肺内的表达分布存在显著差异，肺表面活性蛋白C（Surfactant Protein C，SP-C）是四种肺表面活性蛋白中唯一呈现肺泡II型上皮细胞（Type II Alveolar Epithelial Cells，ATII）严格限制性表达的蛋白，使得SP-C启动子成为AAV病毒在II型（ATII）细胞特异性表达的主要启动子，主要由近端启动子区（-318 bp至+18 bp）内的转录因子结合位点决定，其中甲状腺转录因子-1（TTF-1），核因子I（NFI）和GATA结合蛋白6（GATA-6）的结合位点是核心调控因子。
2. iCre酶介绍
iCre（codon-improved Cre recombinase）是对噬菌体P1来源的Cre重组酶进行密码子优化改造的升级版本。传统的Cre重组酶在原核宿主中进化而来，其编码序列含有较高的CpG二核苷酸含量，在哺乳动物细胞中易引发表观遗传沉默，导致表达效率低下和重组活性不稳定。iCre通过将编码序列调整为哺乳动物偏好的密码子使用频率，在保持氨基酸序列和酶活性不变的前提下，显著提高了重组酶在哺乳动物细胞中的表达水平、mRNA稳定性和翻译效率，同时降低了CpG含量以减少表观遗传沉默风险。自2002年首次报道以来，iCre已广泛应用于转基因小鼠、斑马鱼等模式生物的构建，成为条件性基因敲除和谱系示踪研究中不可或缺的工具。
Cre重组酶是来源于噬菌体P1的I型拓扑异构酶，由343个氨基酸组成，分子量约38 kDa。该酶能够识别并结合34 bp的LoxP位点，介导两个LoxP位点之间的DNA重组反应。LoxP位点由两个13 bp的反向重复序列（作为Cre蛋白的结合位点）和一个8 bp的核心间隔区（决定重组的定向性）组成。
Cre重组酶无需ATP或其他能量辅助因子即可催化重组反应，其作用机制包括四个关键步骤：两个Cre蛋白分子分别结合两个LoxP位点的反向重复序列；通过蛋白-蛋白相互作用将两个LoxP位点靠近；在核心间隔区发生DNA链的切割和交换；完成重组并释放产物。根据两个LoxP位点的相对方向，Cre介导的重组可导致三种结果：同向LoxP之间的序列被删除、反向LoxP之间的序列发生倒位、位于不同DNA分子上的LoxP之间发生易位。
表1 不同Cre酶参数比对
| 特点 | Cre | iCre | CreER2 | MerCreMer |
| 全称 | Cre recombinase | codon-improved Cre | Cre-ERT2 fusion | Mer-Cre-Mer fusion |
| 核心改造 | 原始噬菌体序列 | 密码子优化，降低CpG | C端融合ERT2 | N端和C端各融合Mer |
| 时空控制 | 无（组成型） | 无（组成型） | 他莫昔芬诱导型 | 他莫昔芬诱导型 |
| 本底渗透表达 | 不适用 | 不适用 | 中等 | 更低（双重锚定） |
| 表达效率 | 低 | 高 | 取决于设计 | 取决于设计 |
| 适用实验 | 细菌/体外基础实验 | 组织特异性敲除、谱系示踪 | 时间可控的基因删除 | 对背景活性敏感的实验 |
病毒注射方式（注射量：1 × 1011vg/小鼠）
一、传统滴鼻法
(1）、实验动物称重，使用麻醉剂（异氟烷、氯胺酮、赛拉嗪混合液等）或者小动物麻醉机进行麻醉，置于仰卧位。
(2）、用惯用手捏住小鼠颈背部皮肤，非惯用手拇指轻压下颌使其张口，食指轻压鼻梁，将头部以约45°角固定，确保气道通畅开放，避免压迫颈部影响呼吸.
（3）、用带滤芯的移液枪头吸取AAV病毒液，将枪头垂直对准小鼠一侧鼻孔（距鼻孔约2–3 mm），缓慢滴下3–5 μL液滴，待液体被完全吸入后再滴下一滴。每侧鼻孔分次滴入总剂量的一半（通常每侧20 μL，每次3–5 μL，间隔约30秒)
（4）、滴鼻结束后，将小鼠置于37°C加热垫上的空恢复笼中，持续观察至少10分钟直至完全清醒恢复。
传统滴鼻法的原理是利用小鼠的自主呼吸将液滴吸入呼吸道。但是由于小鼠在仰卧位时呼吸道解剖结构的特点，液滴容易经鼻咽部进入食管而被吞咽，导致实际进入肺部的载体剂量显著减少。
a.传统滴鼻法；b.改良滴鼻法；c.气管插管法;d.气管内注射法
(Adapted from [Santry LA, 2017])
二、改良滴鼻法
(1）实验动物称重，使用麻醉剂（异氟烷、氯胺酮、赛拉嗪混合液等）或者小动物麻醉机进行麻醉，置于仰卧位。
（2）取出麻醉小鼠后，将小鼠身体呈45–60°倾斜角（较传统法略大），以重力辅助液体流向气管方向。拇指轻压下颌使其微张，食指轻压鼻梁，但避免过度后仰以防止气管扭曲。（需2人配合完成）
（3）第一轮给药：操作者A将总剂量的一半（如40 μL分两次，每次20 μL）进行滴鼻。每侧鼻孔采用3–5 μL/次的微量分次方案，每滴间隔30秒以上，确保每滴液体完全吸入后再滴下一滴。
第二轮给药：第一轮完成后将小鼠放回恢复笼，待其完全清醒并恢复活动（约15–20分钟）后，再次麻醉进行第二轮滴鼻，操作同第一轮。
（4）滴鼻结束后，将小鼠置于37°C加热垫上的空恢复笼中，持续观察至少10分钟直至完全清醒恢复。
改良滴鼻法在传统方法基础上进行了两处关键改进：其一，小鼠在给药时保持45°倾斜体位（头朝上）；其二，用手指轻轻捏住小鼠嘴巴，防止经口呼吸和吞咽。这两项改进旨在促进液体经鼻吸入并进入下呼吸道，同时最大限度地减少经口吞咽导致的载体丢失。
2.3 气管插管法
(1）实验动物称重，使用麻醉剂（异氟烷、氯胺酮、赛拉嗪混合液等）或者小动物麻醉机进行麻醉，将小鼠仰卧位固定于操作台，头部尽量后仰以拉直口腔-咽部-气管通路。用缝合线穿过上门齿并向后牵拉固定，使口腔张开。
（2）喉镜叶片轻轻压下舌根部，在光源辅助下观察到会厌软骨和声门裂。将PE-10导管前端蘸取少量无菌生理盐水润滑，沿口腔中线轻柔插入，当导管前端通过声门进入气管时，可观察到导管内液面随呼吸节律上下波动，此为确认导管位置正确的关键体征，确认位置后，用胶带或缝线将导管固定于小鼠口角。
（3）用微量注射器吸取AAV病毒液（推荐按3 μL/g体重计算注射体积），连接至导管外口，缓慢推注（约10–15秒完成）。推注完毕后，立即用1 mL无针注射器连接导管，注入0.2 mL空气，重复2–3次，以减少AAV在导管内的残留。
（4）注射完成后拔出导管，立即将小鼠从操作台取下，侧卧于加热垫上。用镊子轻张口以利呼吸通畅，持续观察直至呼吸平稳、完全清醒后放回饲养笼。
三、气管内注射法
(1）实验动物称重，使用麻醉剂（异氟烷、氯胺酮、赛拉嗪混合液等）或者小动物麻醉机进行麻醉。（2）碘伏和酒精棉球交替擦拭颈部腹侧正中区域，共2分钟，在喉结下方约0.5 cm处做约0.5–1 cm纵行皮肤切口，用止血钳或镊子钝性分离皮下组织和颈前肌群，暴露气管（呈半透明环状软骨结构）。（3）将25G蝴蝶针或胰岛素注射器（含AAV病毒液）沿气管环间隙斜向刺入气管腔内，进针角度约30–45°。判断针尖进入气管的指征：注射器内可观察到液柱随呼吸节律上下波动，或连接注射器回抽可见气泡。缓慢推注病毒液（推荐按3 μL/g体重计算体积），约30秒内完成。（4）注射完毕后快速拔出针头，用无菌纱布轻压穿刺点止血（通常1–2分钟即可止血）。皮肤切口用氰基丙烯酸酯皮肤粘合剂粘合，或用5-0缝线缝合1–2针。（5）小鼠置于37°C加热垫上苏醒，给予抗生素（如头孢类）预防感染，术后前2天每日检查切口情况
参考文献：
Keaveney MK, Rahsepar B, Tseng HA, et al. CaMKIIα-Positive Interneurons Identified via a microRNA-Based Viral Gene Targeting Strategy. J Neurosci. 2020;40(50):9576-9588. doi:10.1523/JNEUROSCI.2570-19.2020
Umpierre AD, Bystrom LL, Ying Y, Liu YU, Worrell G, Wu LJ. Microglial calcium signaling is attuned to neuronal activity in awake mice. Elife. 2020;9:e56502. Published 2020 Jul 27. doi:10.7554/eLife.56502
Sun F, Zhou J, Dai B, et al. Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo. Nat Methods. 2020;17(11):1156-1166. doi:10.1038/s41592-020-00981-9
Dana H, Mohar B, Sun Y, et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 2016;5:e12727. Published 2016 Mar 24. doi:10.7554/eLife.12727
Dana H, Sun Y, Mohar B, et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 2019;16(7):649-657. doi:10.1038/s41592-019-0435-6
Liang Z, Ma Y, Watson GDR, Zhang N. Simultaneous GCaMP6-based fiber photometry and fMRI in rats. J Neurosci Methods. 2017;289:31-38. doi:10.1016/j.jneumeth.2017.07.002
Ouzounov DG, Wang T, Wu C, Xu C. GCaMP6 ΔF/F dependence on the excitation wavelength in 3-photon and 2-photon microscopy of mouse brain activity. Biomed Opt Express. 2019;10(7):3343-3352. Published 2019 Jun 14. doi:10.1364/BOE.10.003343
Dana H, Chen TW, Hu A, et al. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo. PLoS One. 2014;9(9):e108697. Published 2014 Sep 24. doi:10.1371/journal.pone.0108697
Ding J, Luo AF, Hu L, Wang D, Shao F. Structural basis of the ultrasensitive calcium indicator GCaMP6. Sci China Life Sci. 2014;57(3):269-274. doi:10.1007/s11427-013-4599-5
Steinmetz NA, Buetfering C, Lecoq J, et al. Aberrant Cortical Activity in Multiple GCaMP6-Expressing Transgenic Mouse Lines. eNeuro. 2017;4(5):ENEURO.0207-17.2017. Published 2017 Sep 6. doi:10.1523/ENEURO.0207-17.2017
Chen YC, Bullock B, Ogbeh DI, et al. In vitro modeling of human dorsal root ganglion neurons for GCaMP6-based calcium imaging of sensory responses to HSV-1 infection. J Virol Methods. 2026;339:115264. doi:10.1016/j.jviromet.2025.115264
Hussain S, Sedlacek M, Cui R, et al. Spontaneous calcium transients in hair cell stereocilia. Sci Rep. 2025;15(1):33660. Published 2025 Sep 29. doi:10.1038/s41598-025-17976-1
Mallmann RT, Gonzalez Mantuano MC, Polomski K, Knerr J, Klugbauer N. Small molecule agonist TPC2-A1-N increases intracellular Ca2+ independent of two-pore channels. J Biol Chem. 2025;301(9):110576. doi:10.1016/j.jbc.2025.110576