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腺病毒(AD)

       

腺病毒(adenovirus,Ad)是一种球形、无包膜、直径约70~80 nm颗粒病毒,腺病毒基因组为大小为36kb的双链线性DNA,两端各有长约100 bp的反向重复序列,编码30多种”调控蛋白“。腺病毒为20面体立体对称结构,由252个壳粒组成,衣壳含有240个六连体(Hexon),12个五连体(penton)和位于表面的纤维状刺突,纤维状刺突由12根纤毛(fiber),以5连体单位为基底由衣壳表面伸出,纤毛顶端形成头结区(Knob),在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体介导的内吞作用进入细胞,而后腺病毒基因组转移至细胞核内,游离于染色体外,但不整合进入宿主细胞基因组。腺病毒已知有52种,分别命名为adl-ad52,研究得最详细是ad2和ad5,广泛应用于疫苗和体外体内基因转导等领域。


一、腺病毒优势
1).可有效转导多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外,并持续表达;
2).病毒滴度高,病毒颗粒相对稳定,并易于纯化和浓缩,且能有效进行增值。
3).腺病毒载体感染的宿主范围非常广,容易制备,操作简单。
4).该病毒可感染分裂和非分裂的细胞,并能得到大量基因产物,不存在激活致癌基因或插入突变等危险。
5).载体容量大可插入7.5kb的外源基因。


二、腺病毒包装系统

      腺病毒包装系统按照重组方式主要分为两种,一种在细菌(BJ5183)中重组,为AdEasyTM腺病毒重组系统,另外一种在QBI-293A细胞中重组,为AdMax腺病毒重组系统。
1.Adeasy腺病毒包装系统
       Adeasy系统,利用E.coil BJ5183 的同源重组机制 完成线性化后的穿梭质粒与骨架质粒之间的同源重组过程,获得重组腺病毒。基恩科通过自主研发对其包装系统进行优化,提高了重组效率,缩短了构建时间。目前基恩科构建有腺病毒干扰系统,腺病毒基因编辑系统,腺病毒点突变系统,及腺病毒相关产品,BJ5183感受态,BJ5183Adeasy-1感受态,腺病毒滴度测定试剂盒,特殊工艺生产重组效率高。基恩科包装的腺病毒滴度高,感染效率高,用qPCR检测病毒滴度方法可精确到病毒粒子数,严格的质量控制,可选择的纯化工艺超滤、超离及特殊要求的内毒素检测都可实现。可为客户提供量身定制的腺病毒包装服务。
2.AdMAX腺病毒包装系统
       通过Cre/loxP获得重组病毒,这个过程发生在293细胞中,从而避免在细菌中重组。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞,利用Cre/loxP系统的作用实现重组。基恩科腺病毒系统除Adeasy系统外,AdMax系统包装也很完善,对其包装质粒提取工艺进行优化,大大提高质粒纯度及浓度。以其周期短,重组效率高,病毒滴度高的优势成为最佳选择包装系统。

三、腺病毒包装服务

服务产品

包装系统

产品类型

产品用途

干扰腺病毒包装定制

Adeasy系统

pAdtrack-shRNA

表达shRNA

AdMax系统

pDC316-shRNA

CRISPR/Cas9腺病毒定制

Adeasy系统

pAdtrack-U6-spCas9-EGFP

基因敲除

AdMax系统

pDC316-U6-spCas9-EGFP

基因敲除

双荧光素定制

Adeasy系统

pShuttle-CMV-Luciferase

双荧光素

腺病毒现货产品
 

Adeasy系统

pAd-mRFP-EGFP-LC3B

自噬

pAd-mRFP-LC3B

pAd-EGFP-LC3B

Cox8-EGFP-mCherry

pShuttle-CMV-Luciferase

双荧光素

pAd-PE2

点突变



四、质量控制
      基恩科生物(GeneCarer)结合《中国药典》,腺病毒相关疫苗中针对疫苗制剂等提出的产品质量和安全性的要求,同时针对细胞实验用病毒/动物实验用病毒/临床用病毒的不同需求,建立企业腺病毒产品质量标准,每一批病毒产品都经过质量部严格检测,测定慢病毒的滴度、纯度和各项生物物理指标。

检测项目

检测方法

质量标准参考结果

颜色

肉眼判定

无色

澄清度

肉眼判定

透明,无异物

粘稠度

移液器吸取

无粘稠和吸液滞后现象

PH

笔式PH计

7.2-7.4

细菌

平板培养法

阴性

真菌

平板培养法

阴性

支原体

Nest PCR

阴性

内毒素

鲎试剂

≤50TU/mL

有效滴度

qPCR法

1*1010PFU/ml


五、基恩科生物(GeneCarer)包装腺病毒实例
1.Adeasy系统腺病毒包装实例


Ad-mRFP-EGFP-LC3B

2.AdMax系统腺病毒包装实例


Ad-EGFP-Fetub-155


六、现货产品
       基恩科生物提供腺病毒包装定制服务,不同穿梭质粒构建服务,不同包装系统所需各种质粒,细胞,培养试剂等产品。

货号

产品

滴度

规格

GC040500250

pAdtrack-shRNA

1*1010PFU/ml

8管50ul/支

GC040500252 GC040500252 GC040500252

pDC316-shRNA

1*1010PFU/ml

8管50ul/支

GC040600253

pAdtrack-U6-spCas9-EGFP

1*1010PFU/ml

8管50ul/支

GC040600254

pDC316-U6-spCas9-EGFP

1*1010PFU/ml

8管50ul/支

GC040600254

pShuttle-CMV-Luciferase

1*1010PFU/ml

8管50ul/支

GC040100259

pAd-mRFP-EGFP-LC3B

1*1010PFU/ml

8管50ul/支

GC040300256

pAd-mRFP-LC3B

1*1010PFU/ml

8管50ul/支

GC040300257

pAd-EGFP-LC3B

1*1010PFU/ml

8管50ul/支

GC040300258

Cox8-EGFP-mCherry

1*1010PFU/ml

8管50ul/支

GC040100259

pAd-PE2

1*1010PFU/ml

8管50ul/支