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慢病毒(LV)

       

慢病毒(Lentiviral):逆转录病毒科,慢病毒属,主要有人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、猿类免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)、猫免疫缺陷病毒(felines immunodeficiency virus, FIV)、马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus, EIAV)、山羊类关节炎-脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus, CAEV)、牛免疫缺陷病毒(bovine immunodeficiency birus, BIV)等等,为二倍体正链RNA病毒。慢病毒潜伏期长,Lenti-在拉丁语中为“慢”的意思,可以将病毒基因组整合在宿主基因中长期表达,对分裂细胞和为分裂细胞均具有很强的感染率,细胞研究首选病毒载体慢病毒可以将目的基因整合在宿主基因基因组中长期表达。

 

   gag -----群抗原基因,编码核心蛋白基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白等              
   pol -----多聚酶基因,编码病毒复制所需的酶,如反转录酶、整合酶、蛋白酶
   env -----包膜蛋白基因,编码包膜蛋白gp120 及gp41,决定病毒感染宿主的靶向性     
   tat -----基因反式激活因子,参与HIV-1基因RNA转录的控制
   rev ---- 病毒蛋白表达调节因子,能增加gag和env基因对结构蛋白的表达                    
   vif -----病毒感染因子, 其作用是在一些细胞因子的协下促进HIV-1在细胞内复
   Vpr -----R蛋白能使HIV在巨噬细胞中增殖                                                                    
   vpu -----U蛋白,能促进HIV从细胞膜上释放
   nef ----负因子,具有抑制HIV-1增殖作用                                                                    
   LTR ----两端长末端重复序列,内含复制所需的顺式作用元件

 

   HIV-1是研究最深入和改造使用最充分的慢病毒。HIV的单链RNA基因组长度约为9 kb,包括三个主要结构基因:gag,pol和env。gag基因转录成未剪切mRNA, 然后切割成编码病毒的核心蛋白包括衣壳蛋白(CA/p24),主要作用是通过包被病毒颗粒中的病毒RNA并与之紧密结合来保护病毒基因组、内膜蛋白(MA/p17),为病毒体组装和感染非分裂细胞所必须、和核衣壳蛋白(p7),通过包被病毒颗粒中的病毒RNA并与之紧密结合来保护病毒基因组;pol基因编码病毒复制相关的酶;env基因编码病毒包膜糖蛋白。此外,病毒基因组还编码两个调节蛋白,即tat、rev,rev主要参与蛋白调节的表达水平,tat参与蛋白转录的控制,与病毒的长末端重复序列(long terminal repeats, LTRS)结合后促进病毒的所有基因的转录。以及四个辅助蛋白,即vif、vpr、vpu、nef。两端两个LTR位于病毒基因组的侧面,是病毒转录、逆转录和病毒基因组整合所必须的,ψ基因位于5'-LTR和gag基因之间,是基因组二聚化和包装的必须信号。

 

一、重组慢病毒系统简介

  重组慢病毒载体是在慢病毒基因特性的基础上,表达载体保留病毒复制,整合、包装所必须的必须顺式作用原件(LTRs,ψ等),同时表达目的基因(cDNA,shRNA或miRNA);出于生物安全性考虑,将慢病毒的反式作用原件gap、pol,env等基因用辅助质粒表达(GC helper1)表达,表达水泡性口腔炎病毒(VSV)糖蛋白(G)的包膜蛋白载体((GC helper2),三质粒共转染HEK-293T细胞,收集病毒,病毒浓缩纯化,病毒滴度测定和质量检测。


二、慢病毒包装服务:
  基恩科生物(GeneCarer)根据实验目的需要构建不同的表达载体(过表达、敲除、干扰)等,GC helper 1.0质粒和GC helpher 2.0质粒,3质粒用磷酸钙法共转染293T细胞,48h,96h各收集一次上清,进行过滤、离心、浓缩、纯化,分装后进行病毒滴度测定和质量检测。

 

 

 

三、慢病毒载体的选择:

基恩科生物(GeneCarer)提供各种慢病毒载体可供选择,不同启动子,不同筛选标记,不同蛋白标签。

 

四、慢病毒的质量控制:

       基恩科生物(GeneCarer)结合《中国药典》,多糖结合病毒疫苗中针对疫苗制剂等提出的产品质量和安全性的要求,同时针对细胞实验用病毒/动物实验用病毒/临床用病毒的不同需求,建立企业病毒产品质量标准,每一批病毒产品都经过质量部严格检测,测定慢病毒的滴度、纯度和各项生物物理指标。

 

检测项目

检测方法

质量标准参考结果

颜色

肉眼判定

无色

澄清度

肉眼判定

透明,无异物

粘稠度

移液器吸取

无粘稠和吸液滞后现象

PH

笔式PH计

7.2-7.4

细菌

平板培养法

阴性

真菌

平板培养法

阴性

支原体

Nest PCR

阴性

内毒素

鲎试剂

≤50TU/mL

纯度

SDS-PAGE(银染)

仅目的蛋白(无杂带)

有效滴度

qPCR法

≥2E+8TU

 

 

五、慢病毒定制服务:
  基恩科生物(GeneCarer)提供慢病毒现货和慢病毒定制服务,提供基因(含circRNA lncRNA、microRNA等)过表达、基因干扰、基因敲除慢病毒,具体实验服务流程如下图:

 

 

 

六、慢病毒与其他病毒载体的比较

病毒

腺相关病毒

单纯疱疹病毒

     

包装容量

8Kb

8Kb

8Kb

4.7Kb

理论最大150kb

病毒基因组

RNA病毒

RNA病毒

双链线性DNA病毒

单链线性DNA病毒

双链线性DNA病毒

感染细胞类型

大部分分裂/不分裂细胞

大部分分裂/不分裂细胞

大部分分裂/不分裂细胞,原代细胞感染率高

不同血清型感染不同细胞

大部分分裂/不分裂细胞,神经元细胞感染率高

感染效率

基因组整合

整合

非整合

非整合

非整合/部分整合

非整合

表达方式

稳定表达

瞬时表达

瞬时表达

瞬时表达/部分长期表达

瞬时表达

免疫原性

低免疫原性

低免疫原性

高免疫原性

低免疫原性

高免疫原性

 

 

七、相关产品

慢病毒现货、cDNA、细胞等