慢病毒包装试剂盒（升级版）

【产品概述】

基恩科（Gene carer）生物慢病毒包装试剂盒（Lentiviral Packing Kit）由优化的慢病毒包装辅助质粒混合物（Lentiviral Mix）,高效转染试剂、慢病毒浓缩液，病毒感染增强剂四部分组成。适用于基因过表达或基因干扰的慢病毒的包装，以及后续稳转细胞株的构建。

【主要组成】

【自备试剂】：无菌水，PBS缓冲液，3%FBS+DMEM培养基，10%FBS+DMEM培养基

【收毒液配制】：收毒液：10%FBS+DMEM培养基+1%辅助收毒液A+1%辅助收毒液B（现配现用）

【运    输】：冰袋运输

【实验前准备及重要注意事项】

1.慢病毒表达载体：基恩科慢病毒包装试剂盒可以包装Plenti-，Plvx，PCDH等系列慢病毒表达载体，psiH1-，plk0.1-等干扰表达载体。

2.表达载体质量：无内毒素提取慢病毒表达载体DNA，质粒DNA溶于无菌的TE或ddH2O中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA 的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度≥500ng/uL。

3.细胞状态：良好的细胞状态对病毒的包装至关重要，避免细胞培养基有细菌、真菌或支原体的污染，尽量使用传代次数较少的细胞，如果细胞是刚复苏的话，最好传两代之后再包装。

【实验步骤】：以10cm培养皿为例

1）293T细胞分盘：转染前一天，将已经长好的细胞以合适比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到60%-80%时准备转染。

2）转染前换液：转染前1～2h将需要转染的细胞换新鲜的培养基（3%FBS+DMEM培养基），12mL/10cm皿。（注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞。）

3）转染：取无菌的15mL离心管，加入1.5ml的基础培养基，按下列组分配制反应体系：

加入30ul高效转染试剂A液（组分2），混匀。室温放置15～20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，缓慢摇匀培养皿使转染试剂均匀分布后置于CO2培养箱中培养。

4）换液：转染18～20 h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中（注意：此时培养基中已含有少量的病毒，必须经处理后才能丢弃，所用的移液枪头等必须经消毒液浸泡处理后才能丢弃），加10mL新鲜的收毒液继续培养。

5）病毒收集：换液24h后，吸取细胞上清液于50mL离心管（4℃保存），加10mL新鲜的收毒液继续培养。换液24h后，吸取细胞上清液于前一次离心管中，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，并确定过滤后病毒上清液体积。

6）病毒浓缩：将慢病毒浓缩液（5×）按照1：4的比例添加到过滤后的病毒上清液中（如有20mL病毒上清液，则需要加5mL慢病毒浓缩液），置于冰上，每20～30min上下混合一次，共进行3～5次；连同冰盒一同4℃放置过夜。

7） 过夜后，离心机4℃，4000g离心20min，离心2次，吸弃上清，可看到管壁病毒沉淀，用适当体积重悬病毒沉淀。

8）病毒分装与保存：将病毒以40～50μL分装，后保存于-80℃。