【产品概述】
基恩科（Gene carer）生物慢病毒包装试剂盒（Lentiviral Packing Kit）由优化的慢病毒包装辅助质粒混合物（Lentiviral Mix）,高效转染试剂、慢病毒浓缩液，病毒感染增强剂四部分组成。适用于基因过表达或基因干扰的慢病毒的包装，以及后续稳转细胞株的构建，或直接用于动物体内注射。
【主要组成】
组分 | 货号 | 产品名称 | 10次 | 20次 | 保存 |
组分1 | GC020100546 | 慢病毒包装辅助质粒Mix | 300ul | 600uL | -20°C |
组分2 | GC121001576 | 高效转染试剂 | 300ul | 600ul | -20°C |
组分3 | GC121001699 | 慢病毒梯度浓缩液（5×） | 50mL | 100mL | 4°C |
组分4 | GC231000538 | 慢病毒感染增强剂（100×） | 500ul | 1mL | 4°C |
组分5 | GC020400115 | CoGFP阳性对照质粒（Amp+） | 20ug | 40uL | -20°C |
组分6 | GC230101700 | 辅助收毒液A | 200uL | 400uL | 4°C |
组分7 | GC230101701 | 辅助收毒液B | 200uL | 400uL | 4°C |
【自备试剂】：无菌水，PBS缓冲液，3%FBS+DMEM培养基，完全培养基：10%FBS+DMEM培养基
【收毒液配制】：收毒液：10%FBS+DMEM培养基+1%辅助收毒液A+1%辅助收毒液B（现配现用）
【运 输】：冰袋运输
【实验前准备及重要注意事项】
1.慢病毒表达载体：基恩科慢病毒包装试剂盒可以包装Plenti-，Plvx-，PCDH-等系列慢病毒表达载体，psiH1-，plk0.1-，Lenti-CRISPR等干扰或敲除表达载体。
2.表达载体质量：无内毒素提取慢病毒表达载体DNA，质粒DNA溶于无菌的TE或ddH2O中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA 的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度≥500ng/uL，质粒质量和浓度会影响慢病毒滴度。
3.细胞状态：良好的细胞状态对病毒的包装至关重要，避免细胞培养基有细菌、真菌或支原体的污染，尽量使用传代次数较少的细胞，如果细胞是刚复苏的话，传两代之后再进行病毒包装。
4.病毒包装转染前293T细胞汇合度约60%-70%最佳，细胞汇合度太低影响转染后细胞状态，汇合度太高影响转染效率。
5.包病毒后16-18h换液，否则转染试剂沉淀会降低病毒滴度。
6.滴度检测用荧光法、抗性法或我公司《滴度检测试剂盒》
【实验步骤】：以10cm培养皿为例
1）293T细胞分盘：转染前一天，将已经长好的细胞以合适比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到60%-80%时准备转染。
2）转染前换液：转染前1～2h将需要转染的细胞换新鲜的培养基（3%FBS+DMEM培养基），10mL/10cm皿。（注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞。
3）转染：取无菌的15mL离心管，加入1.5ml的基础培养基，按下列组分配制反应体系：
组分 | 用量（10cm细胞培养皿） |
慢病毒包装辅助质粒Mix（组分1） | 30uL |
慢病毒表达载体（客户自备）或CoGFP阳性对照质粒（组分6） | 10.5ug |
加入30ul高效转染试剂A液（组分2），混匀。室温放置15～20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，缓慢摇匀培养皿使转染试剂均匀分布后置于CO2培养箱中培养。
4）换液：转染18～20 h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中（注意：此时培养基中已含有少量的病毒，必须经处理后才能丢弃，所用的移液枪头等必须经消毒液浸泡处理后才能丢弃），加10mL收毒液继续培养。
5）病毒收集：换液24h后，吸取细胞上清液于50mL离心管（4℃保存），加10mL收毒液继续培养。换液24h后，吸取细胞上清液于前一次离心管中，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，并确定过滤后病毒上清液体积。
6）病毒浓缩：将慢病毒梯度浓缩液（5×）按照1：4的比例添加到过滤后的病毒上清液中（如有20mL病毒上清液，则需要加5mL新慢病毒浓缩液），10,000 g 离心4小时。
7）吸弃上清或缓慢倒掉上清，可看到管壁病毒沉淀，收集病毒悬液，滴度检测。
8）滴度检测完成后，将病毒以40～50μL分装，保存于-80℃，备用。
