Genecarer Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDG-西安基恩科生物科技有限公司

产品描述

【产品概述】

本产品是使用SYBR GreenI 嵌合荧光法进行qPCR的专用试剂。核心组分是基于化学法修饰的热启动DNA聚合酶，配合针对qPCR优化的反应缓冲液，可以有效抑制非特异性扩增，显著提高扩增效率，从而对靶基因进行准确定量。同时，本产品使用UDG酶和dUTP有效防止PCR产物的交叉污染，数据更准确。本产品为2 ×预混试剂，使用时只需加入模板、引物、ROX Reference Dye（根据qPCR仪选择）和水，使其工作浓度为1×，即可进行反应。

【产品特点】

1.使用化学法修饰的热启动酶，提高灵敏度，增强特异性；

2.使用dUTP和UDG酶，可有效排除先前扩增产物的交叉污染，数据更准确；

3.针对qPCR优化的反应缓冲液，增强特异性，提高扩增效率，重复性好，可信度高；
4.配有适用于不同机型的ROX Reference Dye（调整PCR加样误差引起的管间差异），数据准确。

【产品组成】

Component	GC231000561-01(500rxn/20 μlreaction)	GC231000561-02(2500rxn/20 μl reaction)
2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDGa	4×1.25 ml	5×GC231000561-01
50×ROX Reference Dye Ib	200 μl
50×ROX Reference Dye IIb	200 μl

a.包含热启动酶，UDG酶，dNTPs，dUTP，Mg2 + ，SYBR GreenI 等
b.用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。不同机型ROX Reference Dye使用情况参见下表：

无需添加ROX Reference Dye	Bio-Rad iCycler CFX96, CFX384, iQ, iQ5,MyiQ, Opticon, Opticon 2,MiniOpticon, Chromo4; Qiagen Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor- Gene 6000; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Roche Applied Science LightCycler 480; Thermo Scientiﬁc PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR; Takara TP-800.




添加ROX Reference Dye I（终浓度为1×）	Applied Biosystems 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne, StepOnePlus.

添加ROX Reference Dye II（终浓度为1×）	Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, ViiA7; Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000.

【推荐qPCR体系（以20 μl反应体系为例）】

Component	Volume	Final Concentration
2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDG	10 μl	1×
10 μM Forward Primer	0.4 μl	0.2 μM
10 μM Reverse Primer	0.4 μl	0.2 μM
50×ROX Reference Dye (optional)	0.4 μl	1×
PCR-grade Water	Variable	-
Template	Variable	As Required
Total Volume	20 μl	-

反应体系中各成分的量可根据以下原则进行调整：
1.反应体系中引物终浓度为0.2μM即可得到较好的扩增效果,当反应性能较差时，引物终浓度可以在0.1 - 0.5 μM范围内进行调整;
2.qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确度对最终结果会有很大的影响;推荐将模板稀释后加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性;
3.如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

【PCR条件】

a.退火/延伸时间请根据您使用的Real-time PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整: 使用ABI 7700和7900时至少30秒；使用ABI 7000和7300时至少31秒；使用ABI 7500时至少34秒；
b.仪器类型不同，融解曲线采集程序不尽相同，使用仪器默认融解曲线采集程序即可。

【注意事项】

1.本品尽量避免反复冻融，以免酶活下降。如每次使用量较少，推荐分装后保存；
2.使用前请上下颠倒混匀预混液，请勿涡旋以免产生过多气泡引起反应体系体积变化，进而影响定量结果；预混液经混匀瞬时离心后即可使用；
3.由于本品含有荧光染料SYBR GreenI，因此保存预混液，以及配制反应体系时都应尽量避免强光照射；
4.由于本品检测灵敏度极高，在配制过程中请使用干净灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液器，避免污染。

【常见问题与解决方案】

1.阴性对照中有信号产生
a.模板或试剂被核酸污染：在进行PCR反应前采取标准的预防措施，以降低污染风险；
b.产生引物二聚体：配合融解曲线进行分析。
2.融解曲线出现多个峰
a.存在引物二聚体或其他特殊结构：根据设计原则设计合成新的引物；
b.引物浓度太高：适当降低引物浓度；
c.CDNA模板带有基因组污染：重新制备CDNA模板。
3.定量PCR无扩增曲线
a.反应循环数不够：一般设置循环数为40；
b.确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；
c.确认引物是否降解：长时间未使用的引物可能发生降解，合成新的引物，重复实验；
d.模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品按最高浓度进行检测；
e.模板降解：重新制备模板，重复实验。