lncrna是一类长度＞200nt的非编码rna，以前被认为是“转录噪声”。现在人们普遍认为，其中一些lncrna在基因表达中具有多种调节作用，可以作为形成核组织的结构成分，甚至可以作为其他rna或蛋白质的诱饵实现基因调控。虽然数以万计的lncRNA转录本已经通过高通量测序发现，但大多数lncRNA的生物学功能都未知。为了更好的研究LncRAN的功能，过表达，敲低，敲除等表达调控策略为其研究的常用技术。本文主要阐述如何高效的敲低LncRNA。LncRNA敲低常用的策略有三 种，分别是RNA干扰(RNAi)、CRISPR-Cas系统基因组编辑和反义寡核苷酸。
为了更高效的进行LncRNA敲低，不同LncRNA需要采用不同的策略。首先需要确定LncRNA的定位，因为大部分LncRNA位于细胞核中，亚细胞定位一般通过FISH实验或lncLocator2，lncATLAS等数据库进行预测。 其次是通过LncRNA和基因组分析，LncRNA属于基因间LncRNA，内含子LncRNA，正义LncRNA和反义LncRNA中的那种类型。
方法1：通过RNAi进行LncRNA的敲低
RNAi是基因敲低调控中最长用的工具，但是因为RNAi介导的RNA降解主要发生在细胞质中，因此当LncRNA定位于细胞质中时优先选择RNAi的方法。因此该方法主要用于定位于细胞质中的lncRNAs。
方法二：CRISPR/Cas系统用于LncRNA的敲除和敲低
CRISPR/Cas9主要通过NHEJ产生小的indel造成移码突变，使mRNA翻译被破坏，敲除目的基因。但是LncRNA不存在ORF开放阅读框，无法通过单靶点有效敲除LncRNA，只能通过双靶点（dual-sgRNA）进行大片段基因敲除，通过单克隆筛选大片段敲除纯合克隆，成功实现LncRNA的敲除。但是如果LncRNA属于基因间LncRNA，大片段敲除会同时敲除其他基因，不能采用此方法。
Cas13家族的Cas13a, Cas13b和Cas13d均被证实可以在哺乳动物细胞系中RNA靶向切割，从而实现基因沉默。其中Cas13d家族蛋白CasRx因为体积小，效率高，脱靶率低等被用于RNA的靶向沉默，可以通过慢病毒实现细胞水平LncRNA靶向沉默，也可通过AAV病毒实现体内LncRNA的靶向沉默。
CRISPR干扰(CRISPRi)的不断成熟和简便，通过CRISPRi技术可以有效的对LncRNA进行敲低，包括可以通过文库构建适用与哺乳动物细胞的大规模遗传筛选。
方法三: 反义寡核苷酸（ASO，Antisense Oligonucleotide ）
反义寡核苷酸通常被称为Gapmers，是合成的和嵌合的单链寡核苷酸，通过招募和激活内切酶RNase H结合并切割互补RNA, gapmers通常包含一个中心DNA部分，两侧是修饰的寡核苷酸，如2’- o -甲基RNA (2’OMe)，并锁定DNA-RNA，复合物被RNase H识别，并激活RNase H，进行切割。由于RNase H在细胞核中最为丰富，因此通过反义寡核苷酸策略可有效敲低细胞核中的LncRNA。有研究表明ASO认为ASO更容易入核，适合核内RNA干扰，示，针对主要位于核内的MALAT1，ASO有着较好的抑制效果胞质LncRNA效果比较差。
总之，对于LncRNA的下调，根据LncRNA基因定位和在基因组的分布，不同的LncRNA选择不同的操作工具可以达到事半功倍的效果。基恩科生物提供多种载体和病毒方案，供您构建LncRNA下调细胞模型。
