HEK293细胞专用转染试剂

【自备试剂】：无血清培养基（如Opti-MEM，用于稀释293细胞转染试剂和DNA），质粒DNA（纯度OD260/280=1.8-2.0，浓度≥0.5μg/μL，无菌无内毒素）；PBS缓冲液，10%FBS+DMEM培养基

【运    输】：冰袋运输

【实验前准备及重要注意事项】

1.293细胞：将对数生长期的细胞消化后，用完全培养基稀释至合适密度（如6孔板每孔接种2×10⁵-5×10⁵个细胞），37℃、5%CO培养箱培养24小时，至转染时细胞汇合度达70%-80%。

2.细胞状态：良好的细胞状态对病毒的包装至关重要，避免细胞培养基有细菌、真菌或支原体的污染，尽量使用传代次数较少的细胞，如果细胞是刚复苏的话，最好传两代之后再转染。

【实验步骤】：以6孔板培养皿为例

1.DNA稀释：取无菌离心管，加入无血清培养基（如6孔板每孔用150μL Opti-MEM），按DNA:细胞密度比例加入质粒DNA（如6孔板每孔3μg DNA），轻轻混匀，室温静置5分钟。

2.稀释：另取无菌离心管，加入等量无血清培养基（与DNA稀释液体积相同），按293专用转染试剂:DNA质量比（通常293细胞为3:1，）加入293细胞转染试剂（如3μg DNA对应9μL 293专用转染试剂），室温静置5分钟。

3.复合物形成：将稀释后的293细胞转染试剂溶液逐滴加入DNA稀释液中，轻轻吹打混匀（避免产生气泡），室温静置15-20分钟，至溶液出现轻微浑浊（形成DNA复合物）。

【细胞转染】

1.加入复合物：将配制好的DNA-转染试剂复合物逐滴均匀加入细胞培养孔中，轻轻摇晃培养板使复合物分布均匀

2.培养条件：37℃、5%CO₂培养箱培养16-18小时

【换液与后续培养】

1. 293细胞：培养16-18小时后，吸去含复合物的培养基，加入新鲜的含血清的的完全培养基，继续培养24小时后根据目的蛋白表达时间或报告基因检测时间调整）。

【转染效率的检测】

      1：报告基因检测：若转染带有荧光蛋白（如GFP）的质粒，转染后24-48小时在荧光显微镜下观察荧光细胞比例；若为 luciferase 报告基因，按试剂盒说明裂解细胞后检测发光值。

      2：蛋白表达检测：转染后48-72小时，收集细胞，通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白表达水平。

【注意事项】

1.试剂优化：293细胞转染试剂与DNA比例、转染时间、细胞汇合度需预实验优化

2.无菌操作：所有试剂和耗材需无菌处理，避免污染，避免细菌污染影响细胞活力。

3.血清影响：293细胞转染试剂易与血清中蛋白结合，建议用无血清培养基稀释DNA和293细胞转染试剂；有时候细胞对复合物毒性敏感，可缩短复合物与细胞共孵育时间（如6-8小时）。

4.细胞状态：确保细胞处于对数生长期，活力良好，避免过度汇合或老化，否则转染效率显著下降。

5.安全提示：293细胞转染试剂对皮肤和黏膜有刺激性，操作时需戴手套和护目镜，避免直接接触。

储存条件：293细胞转染试剂-20℃保存，避免反复冻融，建议分装；质粒DNA-20℃保存，无血清培养基2-8℃保存。

有效期：293细胞转染试剂-20℃保存可稳定6个月