【产品概述】
磷酸钙法转染是将DNA引入真核细胞的常用方法。这一技术已经在广泛的细胞类型中使用，可实现瞬时和稳定的转染效果。该方法是基于将含有磷酸钠的HEPES缓冲盐水和含有DNA的CaCl2 溶液进行缓慢混合实现的。 所形成的DNA-磷酸钙共沉淀物可粘附于细胞表面，并可能通过胞吞作用被细胞吸收
【自备试剂】：水，用于稀释293细胞转染试剂和DNA，质粒DNA（纯度OD260/280=1.8-2.0，浓度≥0.5μg/μL，无菌无内毒素）；PBS缓冲液，10%FBS+DMEM培养基
【运 输】：冰袋运输
【实验前准备及重要注意事项】
1.细胞：将对数生长期的细胞消化后，用完全培养基稀释至合适密度（如6孔板每孔接种2×10⁵-5×10⁵个细胞），37℃、5%CO培养箱培养24小时，至转染时细胞汇合度达50%-60%。
2.细胞状态：良好的细胞状态对病毒的包装至关重要，避免细胞培养基有细菌、真菌或支原体的污染，尽量使用传代次数较少的细胞，如果细胞是刚复苏的话，最好传两代之后再转染。
【实验步骤】：以6孔板培养皿为例
1.DNA稀释：取无菌离心管，加入水（如6孔板每孔用135μL 水），加入A溶液15ul，加入B溶液150ul，加入质粒DNA5ug（如6孔板每孔5μg DNA），轻轻混匀，室温静置15分钟，至溶液出现分层（形成DNA复合物）
【细胞转染】
1.加入复合物：将配制好的DNA-转染试剂复合物逐滴均匀加入细胞培养孔中，轻轻摇晃培养板使复合物分布均匀
2.培养条件：37℃、5%CO₂培养箱培养16-18小时
【换液与后续培养】
1. 293细胞：培养16-18小时后，吸去含复合物的培养基，加入新鲜的含血清的的完全培养基，继续培养24小时后根据目的蛋白表达时间或报告基因检测时间调整）。
【转染效率的检测】
1：报告基因检测：若转染带有荧光蛋白（如GFP）的质粒，转染后24-48小时在荧光显微镜下观察荧光细胞比例；若为 luciferase 报告基因，按试剂盒说明裂解细胞后检测发光值。
2：蛋白表达检测：转染后48-72小时，收集细胞，通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白表达水平。
【注意事项】
1.试剂优化：转染试剂与DNA比例、转染时间、细胞汇合度需预实验优化
2.无菌操作：所有试剂和耗材需无菌处理，避免污染，避免细菌污染影响细胞活力。
3.血清影响：有时候细胞对复合物毒性敏感，可缩短复合物与细胞共孵育时间（如6-8小时）。
4.细胞状态：确保细胞处于对数生长期，活力良好，避免过度汇合或老化，否则转染效率显著下降。
5.安全提示：操作时需戴手套和护目镜，避免直接接触。
储存条件：4℃保存，质粒DNA-20℃保存，无血清培养基2-8℃保存。
有效期：4℃保存可稳定12个月
