RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种高效特异的基因缺失性研究工具，是Andrew Fire 和Craig Mello在线虫中发现的一种由双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默现象，几乎存在于所有真核生物中。RNAi已经广泛应用于各种真核生物的基因功能研究，药靶发现及药物筛选。近年来，多种临床试验表明靶向致病基因的RNAi药物具有治疗困扰人类多年疾病的巨大潜力。
RNA干扰是将双链RNA导入细胞引起特异基因RNA降解的一种细胞反应过程,涉及多种蛋白质共同参与。双链RNA进入细胞内后，会被核酶切割成只有21-23nt的小分子RNA片段，即siRNA，随后的siRNA与细胞质内的RNA诱导沉默复合体（RISC）结合，并解旋成单链。其中的正义链会被降解，剩下的反义链会引导RISC与相应互补的mRNA结合，致使RISC切断这段mRNA并使其降解，以导致其无法翻译出蛋白质或调控基因表达。在研究基因功能中，RNAi由于可以特异性地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验中的有力工具。
1.siRNA：(short/small interfering RNAs)合成：原理：在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA。
对于常规的编码基因，转录出的mRNA基本都是定位在细胞质中。对于这种基因的干扰，可以化学合成双链siRNA，即dsRNA。dsRNA通常21～25bp，短小精悍，很容易被转染到目的细胞（系）中，但是缺点就是不能稳定遗传下去。
2.microRNA（miRNA，微小 RNA）干扰载体构建：miRNA是由内源性发夹（hairpin）结构转录产物衍生而来的一种长为 19 nt~25 nt 的单链 RNA。在每种高等动物中，存在 200 种以上的 miRNA，是最大的基因家族之一，约占基因组的 1%。单链RNA主要采用Pol II启动子表达人工设计的微小RNA（miRNA）互补链或多个miRNA互补链，靶向干扰成熟miRNA。
3.shRNA (RNA-Short hairpin RNAs)干扰载体构建：即短发夹 RNA，是设计为能够形成发夹结构的非编码小 RNA 分子，可通过 RNA 干扰来抑制基因的表达。Thomas Rosenquist 和 Greg Hannon 小组联合研究了在哺乳动物种系细胞中 shRNAs 的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。shRNA是可以克隆至表达载体并表达siRNA双链的DNA分子。
可以根据目标基因设计短发卡RNA序列并将其克隆到特定载体上。
miRNA，siRNA，dsRNA 和 shRNA 都是 RNA 干扰技术中用到的小分子 RNA，其不同之处在 miRNA 是单链 RNA，其余均为双链 RNA；siRNA 和 dsRNA 相似；shRNA 需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到 siRNA 而最终发挥 RNA 干扰作用。
三、shRNA常用载体
shRNA常用载体有pLk0.1-U6-ShRNA-Puro和pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro载体，
1. pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro其图谱和元件特点如下所示：1.1慢病毒表达载体，可以用于瞬转或慢病毒包装；
1.2 含H1-promoter用于表达shRNA序列；
1.3 带有GFP和Puro双标签，可用于检测转染效率和抗性筛选
2.PLK0.1-U6-shRNA-hPGK-GFP-Puro其图谱和元件特点如下所示2.1.慢病毒表达载体，可以用于瞬转或慢病毒包装；
2.2含U6-promoter用于表达shRNA序列；
2.3.Puro和GFP双标签，用于荧光观察和抗性筛选
其他干扰载体及元件：
| 载体名称 | 特点 |
| pLKO.1-U6-shRNA-hPGK-puro | Puro抗性 |
| pLKO.1-U6-shRNA-hPGK-Cherry-T2A-puro | Cherry和Puro双标签 |
| pLKO.1-U6-shRNA-hPGK-BSD | BSD抗性 |
| pSIH1-H1-shRNA-CMV-GFP-T2A-BSD | GFP和BSD抗性 |
| pSIH1-H1-shRNA-CMV-Cherry-T2A-BSD | Cherry和BSD抗性 |
| pSIH1-H1-shRNA-CMV-BSD | BSD抗性 |
| pSIH1-H1-Zsgreen-shRNA-CMV-GFP-T2A-BSD | shRNA克隆处增加zsgreen片段，方便酶切 |
四、shRNA引物设计
1.数据库介绍：
以人RNF24基因为例，用pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro作为载体为例，敲减人RNF24基因（基因ID：11237），GPP Web Portal：https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/gene/search，选择Search by Gene如图所示：
2. 输入基因ID，点击Search，如图所示：
3.点击“Show all constructs for this list of genes, e.g. sgRNA, shRNA or open reading frames (ORFs)”下拉找到推荐的靶点序列，如图所示：
4、添加酶切位点和Loop环结构：
继续以上述人RNF24基因为例，在数据库选取某个干扰靶点：GCCTACAAACAGGTTATATTA在该序列两端加上酶切位点，中间插入Loop环，设计shRNA片段
正反向Oligo序列分别为：
RNF-shRNA 1 -F:5’-GATCCGCCTACAAACAGGTTATATTACTCGAGTAATATAACCTGTTTGTAGGCTTTTTG-3’
RNF-shRNA 1 -R
5’-AATTCAAAAAGCCTACAAACAGGTTATATTACTCGAGTAATATAACCTGTTTGTAGGCG-3’
将该Oligo片段正反向混合退火后，即可直接与载体进行连接，构建shRNA干扰载体。