慢病毒载体能够在分裂细胞和静止细胞（包括有丝分裂后神经元）中高效、持久和稳定地表达转基因。因此，它们有望成为治疗性基因转移载体。
转基因的有效和持续表达是通过将前病毒基因组插入宿主细胞染色体来介导的。然而，前病毒的随机插入(称为“插入突变”)，可能会破坏关键基因，如抑癌基因和蛋白激酶/磷酸酶的基因，这可能会导致癌转化或细胞死亡。
病毒前体插入宿主细胞染色体是由病毒整合酶介导的。为了避免插入突变，已经开发了整合有效的慢病毒载体（IDLV），其中突变被引入整合酶基因的编码序列或病毒基因组中整合酶连接和介导插入的位点（att位点）。来自IDLV的非整合前病毒以附加体形式存在于细胞核中，并在神经元细胞中表达转基因至少几个月。因此，IDLV是未来临床应用中更安全、更有前景的基因治疗载体。
尽管如此，IDLV中仍有几个问题有待研究清楚，包括与野生型慢病毒载体（WTLV）相比，IDLV表达的转基因数量；转基因表达持续多久，以及IDLVs用于基因治疗的治疗效果是否与WTLVs相当。
本研究探索了IDLVs转基因表达水平相对于WTLVs长达1年的时间变化。此外，通过检测脊髓小脑共济失调3型模型小鼠（SCA3小鼠）在注射表达治疗蛋白CRAG（collapsin response mediator protein associated molecular associated guanosine triphosphatase）的IDLVs或WTLVs后的行为恢复，来评估IDLVs作为基因治疗载体的有用性。
一、将突变整合酶基因亚克隆到慢病毒包装质粒pCAGkGP1R中
在小鼠干细胞病毒(MSCV)启动子的控制下，我们使用I类整合酶突变产生表达绿色荧光蛋白(GFP)或GFP-P2A-CRAG的IDLV(图1a和b)。该突变对逆转录、整合前复合体的核导入或病毒基因组在细胞核中的环化没有影响。研究中使用的突变包括将第64个天冬氨酸替换为缬氨酸(D64V)，缬氨酸位于整合酶的核心结构域(图1a)。
将突变整合酶基因亚克隆到慢病毒包装质粒pCAGkGP1R中，用于生产IDLV。
显示整合酶的三个结构域和突变（D64V）在整合酶中的相对位置的示意图。
（b） 本研究中使用了人类免疫缺陷病毒（HIV）衍生的慢病毒载体。GFP或GFP-P2A-CRAG的转录由MSCV启动子驱动。GFP-P2A-CRAG的mRNA在P2A序列上被处理。因此，CRAG在受感染的细胞中与GFP分开表达。长末端重复序列（LTR）中的U3区域是自失活的（ΔU3-LTR）。ψ是封装信号，RRE是Rev响应元件。
（c和d）通过定量PCR（c）和蛋白质印迹（d）评估IDLVs和WTLVs的量。
使用相同的方案生产IDLV和WTLV（各四批）。基因组滴度通过定量PCR测量，而分别从四种独立培养物中获得的IDLV和WTLV颗粒的量通过使用针对包膜糖蛋白VSV-G的抗体的蛋白质印迹检测。两组之间没有统计学上的显著差异（ns）。
二、证明整合酶突变对HEK293T细胞中IDLVs的产生没有影响
为了检查整合酶基因的突变是否影响病毒载体的产生，使用相同的方案同时产生IDLV和WTLV。使用IDLV和WTLV各四批，通过定量逆转录酶PCR测定基因组滴度。WTLV和IDLV的基因组滴度分别为1.42±0.18×1011和1.47±0.29×1011载体基因组（vg）ml−1，两组之间没有显著差异（图1c）。我们还评估了IDLV和WTLV的病毒粒子数量，这两种病毒粒子都是通过使用针对包膜糖蛋白、水疱性口腔炎病毒G蛋白（VSV-G）的抗体的蛋白质印迹从四种独立培养物中获得的。印迹上VSV-G的条带强度在WTLV和IDLV之间是可比较的（图1d）。这些结果表明，整合酶突变不影响人胚胎肾293T（HEK293T）细胞中慢病毒载体颗粒的产生。
三、体内检查源自IDLVs和WTLVs的原病毒基因组在HeLa细胞或小鼠小脑细胞染色体中的整合。
1. IDLVs和WTLVs感染HeLa细胞
在6厘米培养皿中用1μl WTLVs和相同体积的具有相同滴度的IDLVs感染培养的HeLa细胞，感染4天后收集细胞，并进行实时定量Alu-PCR。与WTLV相比，IDLV的整合效率显著降低至1/3850；IDLVs与WTLVs的原病毒整合率为2.6±0.6×10−4（Po0.01，n=8对培养物）（图1e）。
（e和f）在体内培养的HeLa细胞（e）或小鼠小脑（f）中，与WTLVs相比，IDLVs的整合显著减少。
2. IDLVs和WTLVs注射小鼠。
将10μl在MSCV启动子控制下表达GFP的IDLV（1.47×1011 vg ml−1）和相同体积的WTLV（1.42×1011 vg ml−1)注射小鼠，注射后1周，在荧光立体显微镜下切除表达GFP的小脑组织。随后，通过实时定量B1-PCR对整合的前病毒基因组进行定量。IDLVs在小脑中的体内整合效率显著降低至WTLVs的1/100（Po0.001）（图1f）。
因此，整合酶中的D64V突变可以明显阻止IDLV在体内培养细胞和小脑中的原病毒整合到宿主细胞基因组中。
四、注射病毒1年后IDLVs和WTLVs在小脑中GFP表达的时空分布。
研究发现，体内IDLVs在小脑内的原整合效率是WTLVs的1/100。
将10 μl的IDLVs (1.47 × 1011 vg ml - 1)和相同体积的WTLVs (2.69 × 1011 vg ml - 1)注射到小鼠小脑中。小鼠在注射病毒后的2、6和12个月被杀死。在病毒注射后2个月和6个月荧光立体显微镜下检测到，IDLVs和WTLVs的整个小脑发出的GFP荧光大体相同(图a、b、g和h)。在病毒注射后1年，IDLVs处理的小脑上的GFP荧光区域(图i)明显减少，而wtlv处理的小脑上的荧光区域没有减少(图c)。
图2:注射WTLVs或IDLVs的小脑中转基因表达水平的时间变化。（a–l）整个大脑、（a–c和g–I）小脑蠕虫矢状切面、（d–f和j–l）代表性GFP荧光图像。小鼠接受了表达GFP（a–f）的WTLV和表达GFP的IDLV（g–l）的注射。分别在注射后2个月（上图）、6个月（中图）和12个月（下图）检测小脑中GFP的表达。
接受WTLVs或IDLVs注射的小脑蠕虫的矢状切面显示GFP主要在浦肯野细胞（PC）中表达，而在分子中的中间神经元中表达效率较低层（图2d、f和j–l）。由于小脑皮层的GFP荧光图像是从靠近病毒注射部位的有效转导区域获得的，因此即使在注射IDLVs 12个月后，PC中的GFP表达似乎也能维持（图2l）。
在用IDLVs或WTLVs处理的小脑中定量检测PC胞体中的GFP荧光强度，并且由IDLVs产生的GFP的荧光水平表示为相对于由WTLVs引起的荧光水平的比率。注射后2个月，IDLV转导的PC中的GFP荧光强度约为WTLV转导的细胞中观察到的荧光强度的93%，并且在IDLV和WTLV处理的小鼠之间，PC胞体中的GFP-荧光强度没有统计学上的显著差异。然而，在注射后6个月和12个月，GFP荧光强度分别显著降低到WTLV荧光强度的87%（Po0.05）和49%（Po0.001）（图2m）。
五、用表达CRAG的IDLVs处理SCA3小鼠，旋转棒性能的恢复
将表达CRAG的WTLV注射到共济失调SCA3小鼠的小脑皮层，该小鼠在PC特异性L7启动子的控制下表达突变型共济失调SCA3。CRAG的表达通过泛素-蛋白酶体途径导致PC中突变型共济共济失调SCA3聚集体的降解，从而治疗共济失调表型。
使用该系统，检查了注射后长达1年的IDLV治疗效果。
将10微升WTLV（超过1.0×1010转导单位/ml−1，大致相当于1.0×1011 vg ml−1或更高）和具有相似基因组滴度的IDLV（均表达GFP-P2A-CRAG）注射到3周龄的SCA3小鼠中，并在病毒注射前和注射后2、6和12个月检查旋转棒的性能。
在加速方案中（图3a），未经治疗的SCA3小鼠仅在棒上停留约20秒，在1岁时，时间逐渐减少到约10秒。在病毒注射后12个月内，接受单独表达GFP的IDLV注射的SCA3小鼠显示出与未注射SCA3小鼠大致相同的旋转棒性能。相反，与未注射的对照SCA3相比，在病毒注射后2个月（Po0.05）和6个月（Po0.01）接受表达GFP-P2A-CRAG的IDLV注射的SCA3小鼠中观察到明显更好的旋转棒性能老鼠。注射后12个月，性能变差，但仍明显优于未注射的对照SCA3小鼠（Po0.05）。从WTLV表达GFP-P2A-CRAG的SCA3小鼠显示出与从IDLV表达GFP-P2A-RAG的小鼠相似的时间过程。然而，在注射后12个月，它们的表现与未注射SCA3小鼠的表现无法区分。
类似地，在恒速方案中（图3b），与未注射SCA3小鼠相比，在病毒注射后2个月（Po0.001）、6个月（Po0.01）和12个月（Po0.05），注射表达GFP-P2ACARG的IDLV，而不是单独注射GFP，显著提高了旋转棒的性能。通过WTLV表达GFP-P2A-CRAG的SCA3小鼠在注射后2个月（Po0.01）和6个月（Po0.05）也显示出比未注射的SCA3鼠更好的性能；然而，与加速模式类似，在注射后12个月，它们的表现与未注射SCA3小鼠的表现无法区分。
图3。通过小脑注射表达CRAG的IDLV在注射后12个月内改善SCA3小鼠的运动行为。（a和b）用旋转棒测试小鼠的运动协调性。在病毒注射前和注射后2、6和12个月，小鼠每天接受8次加速（0–40 r.p.m.）（a）旋转棒试验，随后接受恒定（5 r.p.m.s）（b）旋转棒（各4次试验）。将未注射的SCA3小鼠（未注射，n=7只小鼠）的转子棒性能与注射表达GFP-P2A-CRAG的WTLVs（+WTLV-CRAG，n=5）、表达GFP-P22A-CRAG（+IDLV-CRAG，n=5个）或单独表达GFP的IDLVs（+IDLV-GFP，n=5次）的SCA3鼠的转子棒表现进行比较。与未注射的SCA3小鼠相比，注射表达GFP-P2A-CRAG的IDLVs（而不是单独注射表达GFP的IDLVs）的SCA3鼠在注射后12个月内显著改善了其旋转棒性能。用表达GFP-P2A-CRAG的WTLV处理的SCA3小鼠在注射后2个月和6个月时也改善了它们的性能，但在12个月时没有改善*Po0.05、**Po0.01、***Po0.001（与未注射SCA3小鼠相比）、†Po0.05和††Po0.01（与单独表达GFP的SCA3小鼠比较），通过单因素方差分析（ANOVA），然后进行Tukey的事后检验
六、表达CRAG的IDLV显著降低突变型ataxin-3聚集体
杀死病毒载体注射的SCA3小鼠和未注射的转基因同窝仔，以检测CRAG表达对PC中共济失调蛋白-3聚集体的影响。只检测了GFP阳性区域，因为GFP阴性区域曾经从IDLV中表达CRAG，并在此后表达倒退，与未感染区域无法区分。因此，尽管GFP-P2A-CRAG的表达水平在WTLV组（图4b）和IDLV处理组（图4c）之间似乎相似，但如图2i所示，在IDLV处理的小脑中，GFP表达区域确实受到显著限制。用突变ataxin-3和calbindin标记的HA的免疫组织化学显示，在未注射的SCA3小鼠中，沿着被破坏的PC层有许多大的聚集体（图4a、d、g和j），而在从WTLV（图4b、e、h和k）或IDLV（图4c、f、I和l）表达CRAG的SCA3鼠中，沿着PC层的聚集体的数量和大小减少。
图4。通过IDLV介导的CRAG表达显著减少SCA3小鼠PC中突变型ataxin-3聚集体。（a–l）注射表达GFP-P2A-CRAG的WTLV（中间面板）或IDLV（右侧面板）的SCA3小鼠的小脑切片和未注射SCA3小鼠（左侧面板）的小脑切片在病毒注射后12个月产生。对切片进行GFP（a–c）、HA标记的突变体ataxin-3（d–f）和钙结合蛋白（g–i）的三重免疫染色。合并后的图像显示在最低的面板（j–l）中。（m） 未注射SCA3小鼠和注射表达GFP-P2A-CRAG的WTLVs或IDLVs的小鼠切片中每100μm长度的PC层的PC数量。（n） 未注射SCA3小鼠和注射表达GFP2A-CRAG的WTLVs或IDLVs的小鼠切片中每100μm长度的PC层中GFP阳性PC的数量。（o） 在未注射SCA3小鼠和注射表达GFP-P的WTLVs或IDLVs的小鼠的切片中，每100μm长度的PC层中突变ataxin-3聚集体的数量。
计算了来自未注射SCA3小鼠和通过WTLVs或IDLVs表达CRAG的小鼠（每组超过三只小鼠）的PC层长度超过100μm的PC数量。
通过钙结合蛋白免疫标记显示，未注射的SCA3小鼠（6.3±0.5个PC）和用表达CRAG的WTLVs（7.8±1.1个PC）或IDLV（7.8±0.7个PC）处理的小鼠之间，每100μm长度的PC层的平均PC数没有显著差异（图4m）。证实，在WTLV和IDLV处理的SCA3小鼠之间，检测区域中转导的PC的密度大致相同（图4n）。
然后，计算了沿着100μm以上长度的转导PC层的直径超过10μm2的聚集体的数量。与未注射的对照SCA3小鼠（15.9±1.9个聚集体）相比，IDLVs（3.9±0.6个聚集体，Po0.001）和WTLVs（6.6±0.7个聚集体（Po0.001））的CRAG表达显著降低了100μm长度的PC层中的平均聚集体数（图4o）。
七、结论
在这项研究中，我们在体内检测了IDLVs在小鼠PC中转基因表达的时间过程，并使用SCA模型小鼠评估了与WTLVs相比，IDLVs治疗SCA的可用性。注射表达GFP的IDLV两个月后，PC胞体中mRNA的荧光强度和表达水平与注射WTLV后大致相同。然而，在病毒注射后6个月和12个月，IDLV处理的小脑中的GFP荧光和mRNA水平均显著降低。注射后6个月和12个月，IDLV处理的小脑中的GFP mRNA水平分别约为WTLV处理的脑中GFP mRNA的25%和5%。小脑注射表达CRAG的IDLVs显著挽救了SCA3小鼠的旋转棒性能，其时间过程几乎与注射WTLVs相同
与WTLVs相比，具有编码D64V整合酶的突变基因的IDLVs在体内将前病毒基因组整合到小脑神经元染色体中的能力低约100倍。这一结果表明，IDLV插入突变的几率要低得多，如图3所示。通过小脑注射表达CRAG的IDLV在注射后12个月内改善SCA3小鼠的运动行为。