腺相关病毒（AAV）载体是治疗性基因组编辑的重要递送平台，但受到包装容量的严重限制。同时递送多种载体会限制剂量和疗效，并增加安全风险。本文描述了单载体4.8kb的AAV平台表达Nme2 Cas9的两种用于片段缺失的sgRNA，或具有同源性定向修复（HDR）模板的单个sgRNA。本文还使用CRISPR蛋白来生产通过Nme2 Cas9切割自我失活的载体，进一步介绍了一种基于纳米孔的测序平台，该平台旨在分析rAAV基因组，并作为载体同质性的质量控制措施。证明，通过基于HDR的疾病等位基因校正，可以有效治疗小鼠的两种疾病模型【型遗传性酪氨酸血症（HT-I）和I型粘多糖病（MPS-I）】。这些结果将使单载体AAV的工程化成为可能，从而实现不同的治疗基因组编辑结果。
一、具有同源性定向修复（HDR）模板的单个sgRNA在单载体4.8kb的AAV平台表达Nme2 Cas9。
细菌和古菌的适应性免疫系统被称为聚集的、规则间隔的、短的回文重复序列（CRISPR），以及它们的CRISPR相关蛋白，一直处于RNA引导的基因组工程革命的中心，包括基因组编辑。最广泛采用的CRISPR-Cas基因组编辑平台是Cas9核酸内切酶，它在与设计的单引导RNA（sgRNA）互补的靶DNA序列中产生双链断裂（DSBs）。除了sgRNA外，Cas9还需要原间隔区相邻基序（PAM）的存在，这是一种接近sgRNA互补靶序列的特异性序列。一旦被切割，细胞依靠DNA修复机制通过非同源末端连接（NHEJ）、微同源介导末端连接（MMEJ）或同源定向修复（HDR）来解决这些DSB，后者可以实现广泛的精确确定的修复结果。最广泛使用的Cas9同源物是化脓性链球菌Cas9[SpyCas9，1368个氨基酸（aa）]，它表现出强大的编辑效率，并且由于其短的5′-NGG-3′PAM而具有广泛的靶向范围。SpyCas9工程改变或减少PAM需求。
单一的AAV系统，其中SauCas9、两个sgRNA和一个HDR供体被设计成单个>5kb的载体构建体。然而，这项研究使用了一种缺乏VP2亚基的AAV8衣壳，随着包装容量的增加，产生了低的载体滴度。因此，仍然需要使用可以在临床前和临床规模上生产的成熟衣壳与单载体AAV兼容的精确基因组编辑策略。AAV等病毒载体，它作为递送方式具有很大的潜力，但包装容量严重受限（在大多数情况下<5kb）。在Nme2Cas9（5′-NNNCC-3′PAM）的更小的Cas9、高细胞编辑精度和靶向灵活性的基础上，设计了一体式AAV-Nme2Cas9载体系统，其实用性超过了初始版本，该版本仅编码效应子和一种sgRNA。最小化Nme2 Cas9表达盒：其调节元件和sgRNA提供了额外的编码能力，可用于整合第二种sgRNA。验证了双sgRNA系统的特定排列和方向，以确定其被包装到单个AAV载体中的能力。
二、4种缩短的Nme2 Cas9+dual-sgRNA载体
为了设计具有额外功能的单个Nme2 Cas9载体，创建了一个缩短的Nme2 Cas9+sgRNA主链。Nme2 Cas9结构信息和指导要求的经验测试指导下，截断了重复链，以产生两个缩短的121nt和100nt sgRNA（分别为Nme.sgRNA-121和Nme.sgRNA-100）。将截短的引物克隆到先前发表的Nme2 Cas9-AAV主链中。通过将质粒转染到HEK 293T（人类）和Neuro2a（小鼠）细胞中，对CYBB、LOC 100505797和Fah基因组的编辑效率进行比较，结果表明Nme.sgRNA-100部分损害Nme2 Cas9活性，而Nme.sgRNA-121的性能与全长Nme.sgRNA的性能更一致。在同一主链中包含两个sgRNA可能会诱导截短的载体基因组的形成而对这种设计造成重大障碍。因此设计了携带两个不同位置和方向的sgRNA-121盒的AAV:Nme2 Cas9构建体。将这四个主链中的每一个包装到AAV8衣壳中，并分离病毒DNA。
两种设计主要包含全长、非截短的~4.8Kb基因组
基于纳米孔的实时测序平台，测序数据显示，与主要包含从ITR到ITR的全长基因组的双sgRNA:Design 4载体不同，双sgRNA:Design 1产生了高频率的截短基因组。这些截断主要集中在两个位置，第一个定位在sgRNA表达盒上，产生只携带单个sgRNA的载体；第二个位于h Nme2 Cas9转基因的3′端。
为了测试这些构建体诱导节段缺失的功效，设计1和设计4切除跨越Hpd基因外显子3和4的606bp片段的能力。
分析表明，只有当间隔物gRNA-I和gRNA-II共表达时，这两种质粒才能有效地产生预期的节段缺失。
二、注射小鼠，验证AAV效果。
编码肝酶富马酸乙酰乙酸水解酶（Fah）的Fah基因通过在外显子5（Fahneo/neo）中插入新霉素表达盒而被破坏。这种疾病在小鼠中的一个标志是，当小鼠不在补充有药物2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基）-1,3-环己烷二酮（NTBC）的水中维持时，体重会逐渐减轻，NTBC阻断FAH上游的酪氨酸分解代谢途径，防止因FAH损失而导致的肝毒性代谢产物的积累。在NTBC退出前对每组中的一只小鼠以及C57BL/6小鼠进行了编辑评估，在NTBC退出后，Fahneo/neo小鼠被有效地从HT-I的致死表型中拯救出来，3周体重稳定；相反，注射PBS的Fahneo/neo小鼠在NTBC停药后4-13天内体重减轻了10%以上，并被安乐死。在NTBC退出前对每组中的一只小鼠以及C57BL/6小鼠进行了编辑评估，在NTBC退出后，Fahneo/neo小鼠被有效地从HT-I的致死表型中拯救出来，3周体重稳定；相反，注射PBS的Fahneo/neo小鼠在NTBC停药后4-13天内体重减轻了10%以上，并被安乐死。
两种双sgRNA载体设计的Nme2 Cas9在体内成功诱导了节段缺失。
在C57BL/6小鼠中，为了不表现出编辑细胞的选择性增殖，用双sgRNA处理：设计1或4在两个靶位点之间分别产生50.5±8.7%和33.6±6%的节段缺失；在NTBC退出前分析的小鼠表现出33.3%（设计1）和15.8%（设计4）的节段缺失效率。NTBC停药和选择性肝细胞扩增三周后，载体设计1和4分别产生35.7±3.3%和33.2±4%的节段缺失。
除了片段缺失外，在两个靶位点观察到显著频率的小indel。
在C57BL/6小鼠中，以2.8±0.7%（设计1）和2.4±0.8%（设计4）的频率检测到DSB位点的载体片段整合，在NTBC退出前以2.3%（设计1）和1.5%（设计4），NTBC退出后以3.5±0.5%（设计1）和2.7±0.5%（设计4）检测到载体片段整合。
与SMRT测序相比，UDiTaS显示片段缺失的频率较低，但反转和载体整合的频率较高。
