腺病毒包装

1953年人类在研究普通感冒病研究中发现了腺病毒，迄今为止已经发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，腺病毒通常通过感染眼、呼吸道或肠胃上皮细胞等感染人类。1977年，Frank Graham博士改造了腺病毒，并在细胞中重组了腺病毒，此后，腺病毒作为一种基因传递方式而被广泛开发。腺病毒(adenovirus，Ad)是一种球形、无包膜、直径约70～80 nm颗粒病毒，腺病毒基因组为大小为36kb的双链线性DNA，两端各有长约100 bp的反向重复序列，编码30多种“调控蛋白”。

腺病毒为20面体立体对称结构，由252个壳粒组成，衣壳含有240个六连体（Hexon），12个五连体（penton）和位于表面的纤维状刺突，纤维状刺突由12根纤毛（fiber），以5连体单位为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头结区（Knob），在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体介导的内吞作用进入细胞，而后腺病毒基因组转移至细胞核内，游离于染色体外，但不整合进入宿主细胞基因组。腺病毒已知有52种，分别命名为adl-ad52，研究得最详细是ad2和ad5，广泛应用于疫苗和体外体内基因转导等领域。

腺病毒基因早期复制周期表达的基因一共有4个，分别是E1，E2，E3，E4，在病毒DNA复制周期晚期表达的基因成为晚期基因，一共有5个，按表达先后顺序依次为L1，L2，L3，L4，L5

E1区位于病毒基因组左侧，可再分成E1A和E1B，与细胞转化有关；

E2区编码DNA结合蛋白，参与病毒的复制；

E3区编码出现在宿主细胞表面的一种糖蛋白；

E4区位于ad2基因组右端，受E2区编码的DNA结合蛋白质调控；

L1-L5通过病毒可变翻译形成5种不同的调节蛋白。

腺病毒的包装系统：

腺病毒包装系统按照重组方式主要分为两种，一种在细菌（BJ5183）中重组，为AdEasyTM腺病毒重组系统，另外一种在QBI-293A细胞中重组，为AdMax腺病毒重组系统。

一、 AdEasyTM腺病毒重组系统

AdEasyTM腺病毒重组系统1998年由He Tong Chuan等改造的一种非常简单易用的双质粒系统，腺病毒基因组质粒pAdEasy-1和转移质粒pShuttle-CMV，pAdEasy-1质粒是Ad5腺病毒基因组，其中删除了E1基因（1-3533bp）和E3基因（28130-30830bp），

E1基因的功能区在293A细胞中得到补充；pShuttle-CMV质粒包含目的基因插入位点、Ad5基因组左右同源臂、Ad5末端重复序列（ITR）、包装信号序列、PacI双酶切位点和卡那霉素抗性。

第一步：将目的基因cDNA插入转移质粒pShuttle-CMV；

第二步：将得到的质粒用PmeI或ECORI内切酶线性化；

第三步：pShuttle-CMV和pAdEasy-1共同转化大肠杆菌BJ5183，双质粒在BJ5183中发生重组，卡那霉素筛选重组子，并酶切鉴定。因为BJ5183有recA重组酶活性但同时又缺失介导细菌本身基因组重组的酶，可以用于质粒重组和转化，得到候选重组子；

第四步：将酶切鉴定正确的重组子转化DH5a感受态，在DH5a中扩大培养，质粒提取，鉴定，PacI酶切线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR）。

第五步：线性化质粒回收后转染293A细胞，产生重组病毒颗粒，收毒，后续纯化浓缩。

另外，也可以采用单质粒两步法重组，即将AdEasy转入感受态细胞BJ5183中，再将pADEasy-BJ5183制备成感受态细胞，将构建好的穿梭质粒pShuttle-CMV用PmeI线性化后直接转化pADEasy-BJ5183感受态细胞，卡那霉素筛选重组子，并酶切鉴定，线性化后转染293A细胞。

注意事项：

1. BJ5183菌株一般卡那霉素工作浓度为10ug/mL，克隆筛选时阳性克隆板子卡那霉素浓度可适当调整；

2. 目的基因序列中有PacI酶切位点时需要进行无义突变；

3.鉴定正确的重组子一定要转化DH5a感受态细胞，因为重组子在BJ5183中是不稳定的。

二 、AdMAX腺病毒包装系统

AdMAX系统腺病毒包装系统是Frank L.Graham教授建立的利用Cre-LoxP或

FLP-frt重组系统进行腺病毒基因组重组的包装系统，该系统由pHBAd系列穿梭质粒、腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre双质粒组成。缺失的 E1 基因在组装感染性病毒颗粒时由 293A 细胞提供，被删除的E3基因不影响病毒的包装，因此可插入高达 7.5kb 的外源基因，双质粒共同转染293A细胞。

AdMax包装系统操作比较简便，重组效率高、重组腺病毒产量较高， AdMax 腺病毒包装共涉及两个质粒，分别为：

1.pHBAd-GFP：携带目的基因序列的穿梭质粒，含Loxp片段

2. pBHGlox(delta)E1, 3Cre：腺病毒包装辅助质粒，含有腺病毒E1/E3缺失的基因组序列，含Cre和Loxp片段

基恩科生物提供腺病毒包装定制服务，不同穿梭质粒构建服务，不同包装系统所需各种质粒、细胞、培养试剂等产品。