miRNA是一类非编码单链小分子RNA，长度为20-24nt，miRNA可能来自于Pre-mRNA的内含子或者基因组的基因间隔区中。
一、miRNA的成熟
RNA酶IIIDrosha-DGCR复合体首先在细胞核中将miRNA原代初转录产物（pri-mRNA）基部切割双链形成60-70个核苷酸的3C末端具有二核苷酸突出（Over-hang）,5C末端具有磷酸基的茎环中间体，即前体miRNA（Pre-miRNA）。然后，通过识别pre-miRNA的3C端的二核苷酸突出信号，转运蛋白Exportin-5与pre-miRNA结合，将pre-miRNA通过依赖Ran-GTP途径运输至细胞质。最后，Dicer识别pre-miRNA双链的3C末端突出以及5C末端磷酸，切断距茎环大约2个螺旋转角的螺旋体的双链，其产物结构类似于siRNA的二聚体，其中pre-miRNA的一条臂产生一个长度与miRNA相同的片段，即miRNA，而成熟的miRNA来自于pre-miRNA的另一条臂。在经过核质转运及切割后，RNA解螺旋酶作用于miRNA：miRNA二聚体，其中miRNA被降解，miRNA则进入RNA诱导的沉默复合物（RISC）中发挥作用。
二、miRNA的主要特征
1.miRNA定位于能潜在编码其前体发夹结构的蛋白质非编码区域。
2.在3C端有1-2个长度的变化，通常长度为21-25nt。
3.Dicer酶从折叠的发夹状转录前体的一条臂上切割得到成熟的miRNA
4.成熟的miRNA序列和预测的发夹结构在不同物种间具有高度的进化保守性。
三、miiRNA的主要功能
1.miRNA指导靶mRNA的切割。
在植物中，miRNA主要进入RNA干涉途径以降解靶分子，因为大多数植物miRNA与靶序列ORF（开放阅读框）完全匹配。miRNA的靶分子位于PIWI结构域中，而其3C末端位于PAZ结构域的亲水性结构域内，两者互相识别互补后，RNA水解酶作用于靶分子中与miRNA的第12或第11碱基所对应的残基的磷酸键，降解靶分子5C端序列
2. miRNA对靶序列进行翻译抑制。
哺乳动物中，靶序列通常于mRNA的3’UTR互补结合，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
四、miRNA的体外调控
1.miRNA过表达的方式主要有2种：
a、合成miRNA mimics ，化学合成的miRNA mimics是双链RNA分子，转染至细胞后模拟内生miRNA发挥作用。
b、表达Pre-miRNA序列，以及两边侧翼序列，模拟体内miRNA生成，通过质粒、慢病毒、腺病毒、AAV病毒等表达，并在细胞模型或体内生成成熟的miRNA
2.miRNA抑制表达的方式主要有3种：
A、反义核苷酸，通过化学合成inhibitor或通过载体或病毒表达miRNA成熟体的反义序列，，一般通过pol III 启动子U6或H1表达，下调miRNA。但是检测无法直接通过QPCR检测，只能通过靶基因表达进行检测。
B、CRISPR/Cas9 方法，通过CRISPR/Cas9对生成miRNA的基因组序列进行编辑，sgRNA可以设计在成熟miRNA位置或前体茎环结构位置，达到破坏pre-miRNA或成熟miRNA的目的，主要优点是可以直接通过QPCR检测。
C、达丰度，缺点是收到PAM的限制，不一定存在合适的sgRNA。
D、Sponge海绵体，海绵体的应用是参考LncRNA和CirRNA与miRNA相互作用方式进行设计，将4-10 个miRNA结合位点串联的表达框，通过II启动子表达在GFP/cherry等基因的3UTR区域，并在RISC切割位点设计几个错配碱基，避免mRNA在吸附miRNA的同时被Ago2介导的核酸内切酶RNase H酶降解，让miRNA远离天然的mRNA靶位点从而出现功能缺失。
| miRNA抑制方式 |
优点 |
缺点 |
是否组织特异性表达 |
QPCR检测 |
| 反义核苷酸 |
合成方便，设计方便 |
无法对富含连续T的miRNA进行敲降 |
否 |
否 |
| CRISPR/Cas9 |
靶向miRNADNA， |
miRNA短，sgRNA设计限制 |
否 |
是 |
| Sponge海绵体 |
长效持续表达，可以同时抑制不同miRNA，适合组织特异性表达 |
没有真正降解miRNA，抑制效果受miRNA表达丰度影响 |
是 |
否 |
Hong Chang等通过CRISPR/Cas9对miR-17、miR-200c 和 miR-141 进行敲低，均实现了目的miRNA不同程度的敲低。
图a:CRISPR/Cas9 敲低miRNA作用原理 图b-d miR-17 miR-200c miR-141 sgRNA设计
QPCR检测miR-17 miR-200c miR-141敲降水平
| miRNA过表达 |
miRNA抑制 |
| miRNA mimics合成 |
miRNA inhibitor合成 |
| miRNA 化学修饰mimics 合成 |
miRNA 化学修饰inhibitor合成 |
| miRNA mimics LNP包裹 |
miRNA inhibitor LNP包裹 |
| miRNA过表达载体构建 |
miRNA抑制表达载体构建 |
| miRNA过表达慢病毒包装 |
miRNA抑制表达慢病毒包装 |
| miRNA过表达腺病毒包装 |
miRNA抑制表达腺病毒包装 |
| miRNA 过表达AAV病毒包装 |
miRNA 抑制表达AAV病毒包装 |
| miRNA过表达稳转细胞系构建 |
miRNA抑制稳转细胞系构建 |
| miRNA 过表达与靶基因双荧光素酶实验 |
miRNA 抑制与靶基因双荧光素酶实验 |
