T7体外转录试剂盒

【基本信息】                                               

【试剂盒内容】

【转录原理】

【转录原理】

1. DNA 模板制备带有T7启动子的线性化质粒或PCR扩增产物都可以作为体外转录模板，模板可以用TE缓冲液或Nuclease-Free Water溶解。 T7启动子序列：TAATACGACTCACTATA

注：RNA 转录的第一个碱基,一般为G，若进行共转录由帽子类似物决定。本试剂盒展示原理为Cap1加帽原理。

（1）质粒模板 将目的DNA插入含有T7启动子的质粒载体中，然后用限制酶进行处理，待完全线性化后进行纯化。    

注1：由于终止子不能保证转录100%终止，环状质粒会转录出不同长度的RNA产物。 为了得到特定长度的 RNA，质粒必须完全线性化。 注2：质粒线性化所选限制酶的酶切位点需要紧邻编码链下游，且在编码链中无识 别位点。选择的限制酶要能形成5'突出末端或者平滑末端。 注3：为了避免蛋白及盐离子等对转录体系的影响，线性化质粒建议纯化后再作为 模板进行体外转录。 注4：质粒DNA抽提过程中引入的RNase A残留会显著影响转录RNA的质量，建 议使用A260/A280为1.8~2.0的高纯度RNase-free模板。

（2）PCR产物模板 带 T7 启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。首先将T7启动 子序列加在编码链上游引物的5'端，然后在高保真酶的作用下扩增含T7 启动子的DNA模板，随后进行转录。PCR产物可以不经纯化直接作为 模板， 但纯化后RNA收率会更高。 

注1：PCR产物作为模板，必须电泳确认产物的特异性及浓度，建议20 μl反应体 系投入2~5 μl PCR产物。 注2：为了得到更多高品质的RNA，推荐PCR产物纯化之后再作为模板进行体外转录。

2. 体外转录

（1）根据所需产物类型选择下面三个反应体系进行反应溶液加样。

①标准体外转录体系在冰上配制如下反应体系：

②加帽RNA共转录体系 在冰上配制如下反应体系：

注：帽子类似物与每种 NTP 的摩尔浓度之比应为 4 : 5，该摩尔比适用于 CleanCap 系列帽子类似物。若使用其它结构的帽子类似物，请根据帽子类似物的说明书设定帽子类似物与GTP的合理比例，可根据加帽效率调整比例，但两者终浓度之和控制在10 mM 为宜。

③非放射性标记RNA体外转录体系

注：本体系适用生物素修饰UTP、荧光素修饰UTP、地高辛修饰UTP或者氨基烯丙基修饰UTP，使用修饰UTP转录产量会比未修饰UTP转录产量偏低。 注1：不同模板序列的转录效率差异较大，初次实验可先按照建议加入量进行，然后再摸索优化最适体系， 模板量可在 0.5 μg~2 μg 的范围进行调整。

（2）充分混匀并瞬离后，37℃温育2 h。若转录产物长度<100 nt，可延长反应时间至3~16 h。
（3）反应结束后，向产物中按照每μg Template DNA加入2 μl DNase I, RNase-free 的比例，37℃孵育15 min以去除 DNA 模板。 
（4）转录后的RNA推荐用磁珠或者柱纯化，也可以采用酚/氯仿或者氯化锂纯化。纯化后的RNA可以进行下游实验或者储存于-80℃备用。
3. 对照模板转录
   对照模板是一个含有T7启动子的线性DNA片段，转录产物大小约4000 nt。在推荐的标准体外转录反应体系中，1 μg对照模板DNA在37℃下反应2 h至少可获得200 μg以上的RNA。

（2）4.产物纯化
转录后的 RNA 可以选用磁珠法进行纯化，也可以采用柱纯化、酚 / 氯仿纯化法或氯化锂沉淀法等，以去除蛋白、游离的核苷酸。纯化后的 RNA 经电泳检测后可进行下游实验或存储于-80℃。
(1) 磁珠纯化法
  按照磁珠说明书进行纯化操作。
(2) 柱纯化法
  纯化前加入 80 μl Nuclease-Free Water 将产物稀释至 100 μl，再按纯化柱说明书进行纯化操作。
(3) 酚 / 氯仿纯化法
  ①向20 μl反应混合物中，加入115 μl Nuclease-Free Water 和15 μl 3 M 乙酸钠(pH5.2)，混合均匀。
  ②加入等体积(150 μl)的酚/氯仿(1:1)混合液抽提一次，室温以最大转速（≥12000 rpm）离心5 min，将上层水相溶液转移至新的RNase-free EP管中。
注：转移上清时请勿吸到中间层。
  ③再加入等体积的氯仿抽提 2 次，收集上清，并转移至新的 RNase-free EP 管中。
  ④加入2倍体积的无水乙醇沉淀 RNA。混合均匀后置于-20℃至少 30 min，以最大转速（≥12000 rpm），4℃离心15 min，收集沉淀。
  ⑤加入500 μl冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀，以最大转速（≥12000 rpm）， 4℃离心5 min ，收集沉淀。
  ⑥用20 μl Nuclease-Free Water 溶解RNA 沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。
(4) 氯化锂沉淀法

（3）采用氯化锂沉淀法，RNA长度至少满足100 nt以上，且浓度不能低于100 ng/μl。
  ①向20 μl反应混合物中，加入30 μl Nuclease-Free Water 和30 μl 7.5 M氯化锂。
  ②混合均匀后，置于-20℃至少30 min，以最大转速（≥12000 rpm），4℃离心15 min，收集沉淀。
  ③加入500 μl冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀，以最大转速（≥12000 rpm）， 4℃离心5 min ，收集沉淀。
  ④用20 μl Nuclease-Free Water 溶解RNA 沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。

5. RNA 定量

(1) 紫外吸收法：游离的NTP等会严重影响定量的准确性，采用此方法 前请先进行RNA纯化。

(2) 染料法：可使用RNA特异荧光染料或相关试剂盒进行RNA定量，可 以对纯化或者未纯化的反应产物中的RNA进行定量。

6. RNA 检测

(1) 凝胶电泳法 为了评估转录本的长度及质量，转录产物应选择合适的非变性或变 性琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测。变性电泳下可减少RNA的 二级结构形成,通常RNA以正确大小的单个条带迁移。

(2) 毛细管电泳法 毛细管电泳法可数字化的精确评估RNA样本的完整性、纯度或降解 程度。与凝胶法相比，此法所需RNA样本量低，灵敏度高。

常见问题及解决办法