【培养保存】

培养体系：RPMI-1640+10%FBS+1%PS

培养条件：气相:空气,95%;CO2,5%;温度:37℃

冻存条件：基础培养基+10%DMSO+20%FBS，液氮保存

【传代步骤】

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次；

2.加 1ml 消化液于培养瓶中，置于 37℃培养箱中消化 2-4 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加胰酶 3 倍体积的培养基终止消化；

3.用巴氏管轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，加入培养液后吹匀；

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按 1：2 的比例分到新的含 6ml 培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按 1:2 到 1:4 的比例进行。

【冻存步骤】

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入 3ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数；

2.5min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和 DMSO，轻轻混匀， DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于 1x10(6)/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识；

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，至少 2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。